Haptoglobina Sérica em Pacientes com Anemia Falciforme e em Portadores do Estigma Falcêmico- Revisitado em 2009.

Pub Arquivos de Anatomia e Antropologia. Instituto de Antropologia Professor Souza Marques- Vol. III – Ano III

Heloisa Helena Arantes Gallo*

Hildebrando Monteiro Marinho**

(monografia apresentada como requisito parcial para a obtenção do título de especialista em hematologia – pós graduação PUCRJ).1978

Summary:

The reticulocyte count and haptoglobins and bilirrubin levels were measured in 33 blood donors, 30 patients with sickle cell trait and 37 patients with sickle cell anemia. The patients with sickle cell trait showed discrete hemolysis and only the haptoglobin levels and reticulocyte counts were able to show it. Some patients with sickle cell anemia (35%) showed haptoglobin levels that were different from zero, suggesting other mechanisms of production, intensity or hemolysis sites, or maybe some compensatory mechanism of hemoglobin production.

Introdução:

A haptoglobina, descoberta pela primeira vez por Polanowski e Jayle em 1938 é uma proteína plasmática heterogênea, que migra eletroforeticamente na fração alfa-2.

Em 1955 Smithies descreveu três tipos geneticamente determinados de haptoglobinas, que classificou Hp 1-1 Hp 2-1 e Hp 2-2,segundo as frações separadas por eletroforese em gel de amido.

Recebeu este nome devido a sua capacidade de fixação a hemoglobina, formando um complexo peroxidase positivo; trata-se de uma pseudo- oxidase.

As haptoglobinas são formadas por dois tipos de polipeptídeos, designados alfa e beta, separados por hidrólise redutora. As variações na estrutura da cadeia alfa são as responsáveis pelos três diferentes padrões eletroforéticos.

A haptoglobina combina-se prontamente a oxihemoglobina, methemoglobina, cadeia alfa isolada de hemoglobina, dímeros alfa beta de hemoglobina e globina livre de heme, mas não se liga a hemoglobina desoxigenada, mioglobina,heme, hemoglobina H ou Barts ou cadeias beta isoladas de hemoglobina.

A natureza precisa das ligações é desconhecida embora se pense que envolvam forças eletrostáticas e ligações de van der walls tornando este complexo muito estável.

Sugeriu-se uma ligação iônica deste complexo, devido a uma grande complementação das duas moléculas asseguradas por ligações salinas entre grupamentos ácidos da haptoglobina e básicos da hemoglobina.

Algumas das propriedades da hemoglobina são perdidas ao se combinar com a haptoglobina, por exemplo, o complexo tem maior afinidade pelo oxigênio do que a hemoglobina A e a forma sigmóide da curva de dissociação da hemoglobina bem como o efeito Bohr é perdido.

O sítio de ligação da haptoglobina foi localizado por Nagel e Gibson na cadeia polipeptídica beta, ligando-se esta especificamente à cadeia alfa da hemoglobina. A ligação normal com a hemoglobina envolve a ligação consecutiva ou a ligação de dímeros alfa-beta, através da cadeia alfa.

Os capilares glomerulares não são permeáveis ao complexo haptoglobina-hemoglobina e sim a hemoglobina livre. Este complexo é muito grande para passar pelo glomérulo renal,o que leva a uma proteção dos canalículos renais contra os efeitos tóxicos da hemoglobina livre eliminada, evitando também a perda de ferro e prevenindo a formação de methemalbumina. A hemoglobinúria somente ocorre quando toda a haptoglobina disponível foi saturada pela hemoglobina.

Foi verificado que quando a hemoglobina é liberada na circulação, ela se combina imediatamente com a haptoglobina e o complexo é removido pelo sistema retículo endotelial. A meia vida do complexo varia com a concentração, quanto maior a concentração, maior a meia vida .

Quando não ligada à hemoglobina, a haptoglobina deixa o plasma com um tempo médio de desaparecimento de cerca de cinco dias. O complexo Hp-Hb desaparece muito rapidamente, com uma meia vida de cerca de nove minutos.

Cerca de 50 a 80% do “turn over” da haptoglobina no indivíduo normal está relacionado com uma rápida remoção do plasma. A célula do parênquima hepático parece ser o principal sítio de remoção do complexo haptoglobina-hemoglobina. Da cinética da haptoglobina, pode ser calculado que 10 a 20% do catabolismo normal da hemoglobina ocorrem intravascularmente e utiliza o sistema haptoglobina.

Nas anemias hemolíticas caracterizadas por hemólise intravascular, o catabolismo da haptoglobina é tão rápido que ela essencialmente desaparece do plasma, uma alteração que não é acompanhada por um aumento compensatório na sua síntese. Hipohaptoglobinemia pode também ser observada em certos estados hemolíticos, associados a mecanismos destrutivos de hemácias, principalmente extravascular. A explicação para este mecanismo não é clara, mas tem se sugerido que alguma hemoglobina possa ser regurgitada das células retículo endotelial quando a taxa de eritrofagocitose ou de fragmentação de hemácias alcancem um máximo.

A ausência de haptoglobina é um dos sinais mais sensíveis de hemólise; ela é tão sensível que ocorre mesmo em doenças que não estão associadas com hemoglobinemia como esferocitose hereditária, eliptocitose hereditária e deficiência de piruvatoquinase. Na maior parte dos pacientes foi encontrado ausência de haptoglobina quando a destruição de hemácias excedia duas vezes a taxa normal, qualquer que fosse o diagnóstico. A medida da haptoglobina pode ser útil em confirmar se houve um episódio hemolítico agudo, mesmo quando não mais se detecta hemoglobina ou methemalbumina no plasma, porque o nível de haptoglobina não retorna ao normal mesmo depois de vários dias após completa a depleção (a não ser que o paciente tenha alguma doença associada que leve a aumento de síntese de haptoglobina). Normalmente haptoglobinas são capazes de ligar cerca de 40 a 150 mg de hemoglobina em cada 100 ml de soro.

Numa destruição sanguínea súbita intravascular (geralmente maior que 30 ml), hemoglobinemia ocorrerá com hemoglobinúria. A urina se tornará rósea, vermelho, acastanhada ou quase preta devido à extrema destruição sanguínea. Este tipo de destruição de hemácias é mais freqüente nas anemias hemolíticas agudas. Nas anemias hemolíticas crônicas, a destruição geralmente ocorre no sistema retículo endotelial. Isto leva a uma desintegração gradati8va de hemácias, fora da circulação, nas áreas sinusoidais, não resultando em um aumento de hemoglobina plasmática e sim na bilirrubina. O nível desta hiper bilirrubinemia dependerá da habilidade do fígado de remover bilirrubina do plasma e excretá-la na bile.

Na anemia falciforme, a fragilidade mecânica das hemácias está aumentada, de tal modo que elas são destruídas pelo baço e durante as crises por hemólise intravascular.

Os valores normais da haptoglobina são variáveis conforme a idade (ausente em 90% dos fetos e em crianças os valores são aproximadamente a metade dos de adultos e o sexo (maiores os níveis em homens do que em mulheres). A administração de estrogênios resulta em redução do nível sérico de haptoglobina e androgênios são responsáveis por sua elevação, dependendo também do tipo genético.

Níveis elevados de haptoglobina são encontrados em doenças como neoplasia metastática, febre reumática aguda, atrite reumatóide, mieloma múltiplo, nefrose, uremia crônica, obstrução biliar e estão também aumentados como resultado da administração de esteróides adrenais e hormônios androgênicos. O aumento da haptoglobina contribui significativamente para o aumento da concentração de alfa-2 globulina que é um achado comum nas condições mencionadas acima.

A haptoglobina tem como função primaria a determinação do destino da hemoglobina liberada de hemácias após hemólise intra ou extra vascular. Sabe-se atualmente que existem dois alelos comuns no lócus genético Hp denominados 1 e 2.Existem diferenças funcionais entre os produtos protéicos Hp 1 e Hp 2 na proteção contra o stress oxidativo derivado da liberação da hemoglobina que parece ter importante significado clínico.Os indivíduos com o genótipo Hp 2-2 e diabetes mellitus (DM) parece ter um risco maior de complicações micro e macrovasculares. Uma estratégia farmacogenomica de administrar altas doses de antioxidantes especificamente para essas pessoas com DM Hp 2-2 tem sido clinicamente eficaz.

A hemoglobin liberada durante um processo hemolítico possui um potencial oxidativo muito elevado. A hemoglobina extracorpuscular pode entrar na parede vascular e mediar a oxidação promovendo o desenvolvimento e progressão da aterosclerose .A haptoglobina no contexto atual vem sendo considerada como uma proteína antioxidante porque ela se liga à hemoglobina (Hb) e bloqueia a lesão oxidativa induzida pela mesma.A haptoglobina também facilita a remoção da Hb do compartimento extravascular via receptor do macrófago - CD163.No homem existem dois alelos comuns para Hp, como dito acima, 1 e 2, e 3 possíveis genótipos diferentes: Hp1-1, Hp2-1, e Hp2-2. Recentemente foi demonstrado em vários estudos longitudinais que o genótipo Hp é um fator de risco independente para complicação vascular em pessoas diabéticas. Especificamente foi demonstrado que indivíduos diabéticos com Hp2-2 são mais susceptíveis de desenvolver nefropatia, retinopatia e doença cardiovascular quando comparado com aqueles com genótipo Hp2-1 ou Hp1-1. Foi encontrado diferença no tipo Hp na reação mediada pelo receptor mediado pelo CD163 antioxidante e pelas suas funções nos diferentes tipos de proteínas Hp.

A nefropatia diabetica (ND) tem um importante impacto na morbidade/mortalidade destes pacientes. Os fatores genéticos estão provavelmente acometidos no desenvolvimento desta complicação microvascular. A Hp protege o rim do stress oxidativo do heme ao se ligar a Hb.Foi feito um estudo neste sentido em pacientes brasileiros diabéticos.Não foram encontradas correlações significativas do polimorfismo da Hp nestes pacientes.

A redução da haptoglobina é comumente encontrada na anemia perniciosa não tratada, nas anemias hemolíticas agudas e crônicas, anemias associadas a hemoglobinas anormais, anemia esferocítica hereditária, hemoglobinúria paroxística noturna e hemoglobinúria a frio. A redução da haptoglobinemia na mononucleose e doenças com lesões hepáticas provavelmente é devida a um aumento da destruição eritrocítica associada a estas doenças. Existem ainda casos de ausências genéticas de haptoglobinas, explicáveis pelo gem Hp0.

O propósito deste trabalho visa:

1- Detectar o grau de hemólise em pacientes com anemia falciforme (homozigotos SS) fora de crise hemolítica.

2- Detectar algum grau de hemólise em portadores do traço falcêmico (heterozigotos AS).

3- Correlacionar os dados laboratoriais de dosagem de haptoglobina com as dosagens de bilirrubinas e contagem de reticulócitos.

4- Comparar a sensibilidade destes diferentes métodos laboratoriais na detecção de hemólise.

Pacientes e Métodos:

Foram estudados 33 doadores de sangue do Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (IEHASC), considerados aptos após o exame de triagem; 37 pacientes com anemia falciforme e 30 portadores do traço falcêmico, diagnosticados a partir do exame eletroforético de hemoglobina feito no Laboratório de Biologia Molecular deste Hospital.

Em todos foram realizadas dosagens de haptoglobina, bilirrubina, hematócrito e contagem de reticulócitos, além da verificação do quadro clínico nos portadores de traço falciforme e naqueles com anemia falciforme.

A coleta foi feito por meio de cuidadosa veno-punção, procurando-se evitar hemólise.O sangue foi colhido em tubos estéreis, sem anticoagulantes para a dosagem de haptoglobinas e bilirrubinas e tubos com anticoagulante citrato para a feitura do hemograma e a contagem de reticulócitos.

A dosagem de haptoglobina no soro foi feita indiretamente, adicionando-se uma quantidade conhecida de hemoglobina (400 mg%), acima da capacidade de ligação da haptoglobina. A mistura foi incubada e a hemoglobina livre foi separada da hemoglobina ligada, por eletroforese. As percentagens das frações foram calculadas por densitometria e a concentração de haptoglobina (como capacidade de ligação a hemoglobina) foi determinada multiplicando-se a percentagem do complexo haptoglobina-hemoglobina pela concentração de hemoglobina adicionada e dividindo por 100.

REAGENTES:

1- Solução de hemoglobina A em torno de 400 mg%.

2- Controle.

a)Soro normal ou soro controle.

3- Tampão fosfato – 0,05M pH 6,4 (solução de trabalho).

Solução A:

a. KH₂PO₄ 1,713 g.

b. Água destilada qsp 500 ml.

Solução B:

c. Na₂HPO₄ 3, 363 g.

d. Água destilada qsp 500 ml.

Misturar:

e. Solução A 73,2 ml.

f. Solução B 26,8 ml.

4- Acetato de celulose (cellogel).

5- Solução de ácido acético a 5%.

6- Solução alcoólica de O- dianisidina.

O- dianisidina 0,143 g.

Etanol a 95% qsp 100 ml.

Misturar até dissolver totalmente. Guardar em refrigerador.

7- Tampão de acetato 1,5 M pH 4.7.

Acetato de Sódio 1,6 g.

Ácido acético glacial 0,53 ml.

Água destilada qsp 500 ml.

Ajustar o pH final entre 4,6 e 4,7 com ácido acético glacial.

8- Peróxido de hidrogênio a 3%.

9- Solução de Trabalho de O Dianisidina

Solução alcoólica de O. Dianisidina 40 ml

Tampão Acetato pH 4.6 a 4.7 10 ml

Água oxigenada a 3% 10 ml

Fazer a solução imediatamente antes de usar.

MÉTODO

1- Em um tubo de ensaio colocar 0,5 ml do soro a analisar e 0,5 ml da solução de hemoglobina (400 mg%). Incubar em banho Maria a 37 graus C durante 30 minutos.

2- Colocar as fitas de acetato de celulose na solução de trabalho durante 10 minutos. Retirar o excesso do tampão entre folhas de papel de filtro.

3- Colocar a solução de trabalho nas cubas e as fitas de acetato de celulose nos suportes da cuba da eletroforese. Fazer contato entre as fitas e o tampão das cubas com esponjas especiais.

4- Com o aplicador, aplicar a solução de soro-hemoglobina nas fitas.

5- Realizar a corrida durante 30 minutos, aplicando uma diferença de potencial de 200 volts.

6- Após 30 minutos desligar a fonte, retirar as fitas e imergi-las em ácido acético a 5% durante 10 minutos. Remover o excesso de ácido, tocando a extremidade da fita no reservatório.

7- Colocar as fitas na solução de trabalho de O-Dianisidina, durante cinco minutos.

Nota: Não agitar as fitas enquanto estiver nesta solução

8-Lavar as fitas totalmente com água destilada (três lavagens).

9-Inspecionar as fitas e interpretar os resultados.

10-Fazer densitometria para quantificar a haptoglobina usando

Um filtro de 420 mm.

Cálculo – conc. HP(mg%)= % do complexo HpHb x 4

Foram feitos também: contagem de reticulócitos e dosagem de bilirrubinas.

Resultados

DOADORES DE SANGUE:

Um grupo de 33 doadores de sangue, 32 homens e uma mulher, com idade que variou entre 20 e 50 anos foram estudados como controle.

O nível médio de reticulócitos foi de 1,02 ± 0,52%; de haptoglobinas: 78,73 ± 36,99 mg% e de bilirrubinas 0,42 ± 0,24mg%. Cerca de 80% tinha dosagem de haptoglobina acima de 60 mg%.

PORTADORES DE TRAÇO FALCEMICO:

Estes pacientes foram diagnosticados inicialmente por testes de afoiçamento e confirmados com eletroforeses de hemoglobinas. Foram estudados 30 pacientes de diferentes grupos etários, variando de 5 a 50 anos, a maioria pertencente à raça negra. Os níveis médios de haptoglobinas foram de 50,54 ± 26,65 mg%. Cerca de 50% apresentavam níveis médios de haptoglobina abaixo do nível médio do grupo controle.

A média das dosagens de reticulócitos foram 1,64 ± 0,57% e de bilirrubinas de 0,59 ± 0,80 mg%.

Em todos esses indivíduos foram feitos hemogramas que se mostraram normais, com um nível médio de HT de 37%. Uma grande parte apresentava concomitantemente eosinofilia ao estudo da série branca por provável infestação parasitária.

Estes indivíduos não possuem sintomas relacionados à anemia falciforme.

Como doenças concomitantes foram observadas: um caso de infarto agudo do miocárdio, uma paciente com lúpus eritematoso sistêmico, um com histórico de espondilite e outro é portador de hemofilia A.

PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME:

Foram estudados 37 pacientes, somente um pertencia à raça branca. Cerca de 50% dos pacientes eram do sexo feminino.

Os pacientes apresentavam:

1- Teste de Afoiçamento positivo

2- Padrão eletroforético de hemoglobina SS

3- Solubilidade de hemoglobina abaixo de 30%, confirmando o tipo de hemoglobina.

4- Curso clínico caracterizado por graus variados de anemia contínua, icterícia com aumento de bilirrubina indireta (crises de hemólise) e aumento de reticulócitos.

Em 95% não havia baço palpável e o fígado estava aumentado de tamanho, variavelmente.

O Hematócrito estava em média em 24%. Foram feitos acompanhamento clínico e laboratorial com hemograma, sendo retirados do estudo os pacientes em crise hemolítica e/ou infecção. Também neste grupo como no precedente havia mais de 30% de pacientes com eosinofilia, muitos já tratados para parasitoses intestinais.

29 dos 37 pacientes apresentavam leucocitose e destes somente três estavam com crise de hemólise e um com infecção (pneumonia), este último apresentando níveis normais de haptoglobina, como já dito, sendo retirados do nosso trabalho.

O nível médio de haptoglobina foi de 7,98 ± 12,15 mg%, 65% em torno de zero e somente 35% apresentava níveis de haptoglobina.

DISCUSSÃO e CONCLUSÃO:

O fato de não se ter encontrado em todos os pacientes SS zero de haptoglobina leva-se a crer que:

1-Há uma provável compensação na produção de haptoglobina.

2-A hemólise durante as fases assintomáticas não é tão intensa a ponto de se saturar totalmente a haptoglobina livre. Há que se considerar que na maioria dos pacientes o nível de haptoglobina encontrado foi de zero. Laurell e Nyman mostraram que uma falta de haptoglobina poderia ser provocada em pessoas normais pela infusão intravenosa de hemoglobina. Donde se infere que durante a fase assintomática destes pacientes sempre ocorre a presença de hemoglobina livre no sangue que se combina com a haptoglobina.

3- A diminuição dos níveis de haptoglobina nos portadores do traço falcemico sugere que estes pacientes também apresentam uma discreta hemólise, sem levar à alteração nos níveis de bilirrubina indireta.

Bibliografia:

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